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避免RNA降解的注意事項

更新更新時間:2022-09-16

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上海連橋生物科技有限公司

避免RNA降解的注意事項

1. 使用正確的細胞或組織儲存條件 

在樣品用液氮瞬間凍結之后,應該儲存在-80°C,千萬不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍,也會導致 RNA 的降解和損失。瞬間凍結的組織應該首先在超低溫條件下先研磨成粉,然后置于裂解液中進行勻漿。RNAfixer 使樣品儲存更為便利。儲存在 RNAfixer 中的細胞或組織可在室溫下穩定保存長達 1 個星期,在 4°C 可穩定保存長達1 個月,或**保存在-20°C。 

2. 消除環境 RNase 的污染 

為了得到完整的、高品質 RNA,在整個 RNA 制備過程中,當 RNA 離開強蛋白變性劑(如離液裂解液或酚)的保護時,避免引入新的 RNase 污染就非常關鍵。由于 RNase 幾乎是**,所以必須確保與純化的 RNA 接觸的每一樣東西都是無 RNase 污染的。所有的表面,包括移液器、工作臺、玻璃器皿和制膠設備,都必須用表面去污凈化溶液如 RNase 噴霧清除劑來處理過,去除各種溶液或者反應緩沖液中可能存在的 RNase 污染,可以用 RNAsafe。必須保證一直使用無 RNase 的槍頭、試管和溶液,手套也應經常更換。 

3. 迅速滅活內源的 RNA 酶,以防止 RNA 降解 

以下 3 個方法均可有效使內源 RNA 酶失活: 

1)用含離液(如胍鹽)的細胞裂解液收獲樣品,并立即勻漿。 

2)用液氮瞬間凍結樣品。值得特別注意的是:組織塊必須保證足夠小,在浸入液氮的瞬間

就能凍結,以確保瞬間令 RNA 酶失活。 

3)立即將樣品置于 RNAfixer 無液氮 RNA 樣品儲存液中。它是一種水相、無毒的收集試劑,

能立即穩定并保護完整、未凍結的組織和細胞樣品中的 RNA。關鍵要點是組織樣品切片一定要夠?。?lt;0.5 cm),這樣 RNAfixer 才能在 RNase 破壞 RNA 之前迅速滲入組織塊中。                                               

4.選擇合適破壁方法 

細胞或組織的*勻漿對 RNA 提取來說,是一個很關鍵的步驟,它能夠防止 RNA 的損失和降解。勻漿的方法應根據細胞或組織的類型來選擇。大部分培養的細胞可以置于細胞裂解液中,通過簡單的渦旋震蕩來勻漿;而動物組織、植物組織、酵母和細菌、真菌則常常需要更加劇烈的方法,通常用液氮研磨。比如說細菌(特別是革蘭氏陽性菌)的細胞壁,就需要溶菌酶消化來實現*的細胞裂解和 RNA 的最大回收,酵母提取時加入破壁酶幫助破壁。 

5.選擇最適 RNA 提取試劑(盒) 

現有眾多的 RNA 分離方法也許令人難以取舍。目前**也是**的方法是柱式分離,也就是結合基于 Trizol 原理的裂解液和硅膠膜吸附柱的使用,是目前比較通用的一種方法。

對于動物細胞,組織,植物葉片等常用材料都基本適用。植物 RNA 的提取比較難抉擇,像根和果實等,由于多糖,多酚物質的存在,很難純化;還有就是血清等液體樣本的提取,水分多或者 RNA 含量少等,較難提取??梢圆捎冕槍π缘脑噭ê校?nbsp;

6. 低濃度 RNA 的沉淀 

純化得到的 RNA 可能需要通過沉淀來濃縮,以滿足一些下游應用的需要。醋酸銨(NH4OAc) 沉淀(加 0.1 體積的 5M  醋酸銨、2-2.5 體積的無水乙醇,-20°C 放置 25 分鐘以上)可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA(ng/ml),可以采用共沉淀(如  linear acrylamide 糖原 glycogen,酵母 yeast  RNA)的方法。核酸助沉劑是 linear  acrylamide,當RNA 用于 RT-PCR 分析時,線性的丙烯酰胺和 DNase 處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑,因為它們都不含 DNA 污染,糖原含量高會抑制 PCR 反應,應注意控制濃度,核酸助沉劑對 PCR 無影響,成為病毒核酸提取的**。酵母 RNA 和未處理的糖原會給樣品帶來核酸污染,有可能影響 RT-PCR 的結果。沉淀后,注意避免 RNA 沉淀過分干燥,因為這可能導致很難重新溶解。 

7.提取好的 RNA 如何儲存 

RNA 最好是提取完成后,立刻進行下游實驗。如果只是短期儲存,重懸的 RNA 應放置于-20°C;如果是長期儲存的話,就應該放置于-80°C。儲存 RNA 時,可以加入少量的 RNA酶抑制劑防止 RNA 的降解。 


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